miércoles, 23 de febrero de 2011

Aplicación del análisis de DNAmt: La tragedia de los Romanov.

Aplicación del análisis de DNAmt: La tragedia de los Romanov.

                El análisis de los haplotipos mitocotondriales ha permitido dilucidar algunas incógnitas históricas, tales como la determinación de los patrones migratorios del Homo sapiens a lo largo del globo, la identificación de los restos de Cristobal Colón o la verificación del origen de Ötzi, la momia humana natural más antigua conocida hallada en un bloque de hielo en los Alpes suizos. Tal vez una de sus aplicaciones más conocidas sea la de la identificación de los restos de la familia del último zar de todas las rusias, Nicolás II y su familia: su esposa Alejandra, las grandes duquesas Maria, Tatiana, Ola y Anastasia y el zarevich Alexis. Toda la familia Romanov fue asesinada durante la revolución bolchevique en 1918, junto con sus sirvientes y el médico inglés de la familia, el Dr. Botkin. 

El destino de sus restos fue una absoluta incógnita hasta que en 1979 se anunció el hallazgo de una fosa común en Yekaterinburg con nueve esqueletos que podrían corresponderse con las exequias de la familia Romanov. Los cuerpos habían sido maltratados y rociados con ácido para dificultar su identificación. Estudios antropológicos de la época constataron que la tipología de los restos (edad, sexo, piezas dentales…) podría corresponderse con los integrantes de la familia real, si bien revisiones posteriores apuntaban indicaban laausencia de los restos de zarevich Alexei y de la gran duquesa Anastasia (González-Martín, 2003). Pese a las dificultades intrínsecas para la obtención de resultados en el análisis de DNA nuclear, se obtuvo una muestra suficiente para genotipar los cuerpos. En primer lugar, se verificó el sexo de los esqueletos (previamente establecido por análisis antropológicos) por la amplificación del gen de la amelogenina. Se estableció el grado de parentesco entre los integrantes de la tumba por el análisis de varios loci tetraméricos microsatélite. En el trabajo original de Gill et al (1994) se emplearon los marcadores Short Tandem Repeats TH01, vWA31, FES/FPS y ACTBP2, estableciendo el genotipo multilocus de los nueve esqueletos de la fosa hallada en 1991. En una posterior revisión en la que se incluyó además los tres cuerpos descubiertos en el año 2007 se utilizó un kit de identificación forense estándar, para los loci TH01, CSF1PO, D2S1338, D18S51, D13S317 y FGA (Rogaev, y otros, 2009). En la figura 1 se resume el tipado genético y las relaciones de parentesco que explican los resultados obtenidos.

                Los datos obtenidos indicaron que dos de los cuerpos adultos hallados podrían corresponder a los padres de los esqueletos de individuos más jóvenes, tanto los de la primera tumba como los de la segunda. Se descartó toda relación de parentesco con los otros cuatro adultos. Pese a todo, no es posible establecer la identidad de un individuo sin una muestra comparativa confirmada, por lo que lo único que podía afirmarse por métodos moleculares era que los individuos formaban una familia de dos padres y cinco hijos y que pertenecían con una altísima probabilidad a poblaciones del centro-este de Europa (al margen de las evidencias antropológicas).


Figura 1: Tras la determinación molecular de sexo y el análisis de seis loci autosómico STR, la composición genotípica de todos los individuos es consistente con la hipótesis de que existen relaciones de parentesco inmediatas, consistentes en dos parentales y cinco hijos. Tal evidencia por sí sola no es suficiente para la identificación de los restos (Rogaev, y otros, 2009). 

No fue hasta el año 1991 cuando las técnicas de análisis de DNAmt adquirieron una robustez suficiente como para establecer conclusiones veraces acerca de la identidad de linaje de los cuerpos. Es menester que recordemos que tal material genético se hereda de exclusivamente por vía materna, de modo que todos los hermanos de una pareja mostrarán el mismo miotipo que su madre, así como otros parientes directos de tal linea. Se estableció el miotipo de los restos, así como de especímenes de descendientes por la vía materna de ambas ramas. Como espécimen de referencia de la rama materna se analizó una muestra del Príncipe Felipe de Edimburgo, pariente por la vía materna de la zarina Alexandra. Los resultados de este análisis fueron concluyentes: el haplotipo mitocotondrial obtenido en cuatro de los esqueletos de mujer hallados en la primera fosa común coincidían con el observado para el duque de Edimburgo, lo que junto con las evidencias antropológicas y genéticas permitió determinar que se trataba de los restos de la zarina Alexandra y de tres de sus cuatro hijas.

En lo referente al zar, la comparación de su DNAmt con muestras de individuos de su linaje materno arrojaron un resultado inconcluso; se halló que su miotipo era idéntico al de dos descendientes vivos, salvo en la posición 16169, para la cual el DNAmt del zar es heteroplásmico (16169 T/C, esto es, en tal posición aparece tanto Timina como Citosina). Los descendientes de una hermana de Nicolás II son homoplásticos 16169 T, en tanto que la descendencia de otra de sus hermanas es homplástica 16169 C. Se interpretó que la madre del zar había incorporado una mutación en tal punto, legando a su progenie su condición heteroplásmica. Para verificarlo se realizó un análisis de los restos óseos del difunto hermano del zar, Jorge de Romanov. La coincidencia de miotipos con el espécimen obtenido de Jorge de Romanov demostraba su parentesco con la familia real. Se cree que esta mutación se perdió en posteriores generaciones debido a un fenómeno de deriva génica o a que no se incluyó en la línea germinal materna (Ivanov, Wadhams, Roby, Holland, Weedn, & Parsons, 1996). Véase la figura 2 para una mayor comprensión de lo explicado.

Los cuatro cuerpos restantes poseían un haplotipo no coincidente con el de la familia real, y a la postre se confirmó, por análisis antropogénicos y revisión de registros históricos, que se trataba del médico real y de tres de sus sirvientes (Hummel, 2003).


Figura 2: Genealogía de la familia real rusa, indicando el haplotipo mitocotondrial que mostraban los distintos individuos, así como la transmisión materna de los mismos. En punteado se indican las muestras de referencia empleadas en la determinación del miotipo de la rama materna y de la rama paterna empleados en la identificación de los restos. La leyenda de los miotipos expresa las no coincidencias de miotipo en la comparación con la secuencia de referencia de Cambridge. 

                De todos modos, restaba todavía la incógnita acerca del destino de los cuerpos del zarevich Alexei y de una de sus hermanas, en un principio se atribuyó que podría tratarse de Anastasia. Mucho se ha especulado sobre la supuesta supervivencia a la masacre de los mencionados niños, especialmente de la gran duquesa desaparecida (si los registros históricos son ciertos, el zarevich Alexei hubiese debido sobrevivir a un pelotón de fusilamiento y a dos tiros en la cabeza, con el agravante añadido de que padecía hemofilia, por lo que su muerte puede darse como un hecho más que confirmado). Todo ello ha llevado al surgimiento de varios casos de fraude, siendo el caso más sonado el de Anna Anderson, una mujer de pasado desconocido y un importante cuadro de enfermedades mentales que afirmaba ser la gran duquesa Anastasia. La secuenciación de su mtDNA disipó toda duda: su miotipo no coincidía con el de la rama materna de la familia Romanov, descartando por completo que pudiera tratarse de la gran duquesa Anastasia. Demostrado esto, ¿quién fue realmente Anna Anderson? Tras un rastreo detectivesco de la procedencia de la mujer se cotejó su DNAmt con el de Carl Macher, supuesto rebisnieto de la impostora. Tal análisis confirmó la verdadera identidad de Ana Anderson, o mejor dicho, Francisca Schazkowska (Gill, y otros, 1994).
                El destino de los niños perdidos se cerró en el año 2007, cuando se confirmó que los dos individuos hallados en una nueva fosa ubicada a 70 metros de la anterior poseían el mismo miotipo que el material atribuido a su madre y hermanos de la cripta de los Romanov. De este modo los dos cuerpos recuperados se corresponden con el finado zarevich Alexei y de su desaparecida hermana. (Coble, Loreille, J., M., & Maynard, 2009). Así se cerró el destino de la dinastía; no hubo flaqueza del bolchevique que permitiera la supervivencia de Anastasia.
Secuencia de referencia
C
T
C
C
C
C
A
C
C
T
T
T


Sirviente 1 (1991)
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C
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Sirviente 2 (1991)
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C
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Sirviente 3 (1991)
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T
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T
G
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C
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Dr. Botkin (1991)
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T
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Zarina Alejandra (1991)
T
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C
Gran duquesa 1 (1991)
T
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C
Gran duquesa 2 (1991)
T
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C
Gran duquesa 3 (1991)
T
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C
Gran duquesa 4 (2007)
T
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C
Zarevich Alexei (2007)
T
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C
Duque de Edimburgo (1991)
T
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C


Zar Nicolás (1991)
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C
Y
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T
T
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Jorge Romanov (1991)
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C
Y
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T
T
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Tabla 1: Alineación de secuencias del DNAmt aislado de los cuerpos hallados en las fosas de la familia Romanov, así como la secuencia de los descendientes por vía materna de ambos linajes empleados para la comparación de haplotipos. La secuencia superior es la secuencia de referencia de Amsterdan. Los puntos indican coincidencias en la secuencia, en tanto que las letras indican las no coincidencias (Hummel, 2003).  El símbolo Y expresa la condición heteroplásmica T/C del zar y de su hermano. Entre paréntesis se indica el año del análisis.

Bibliografía

Coble, M. D., Loreille, O. M., J., W. M., M., E. S., & Maynard, K. (2009). Mystery Solved: The Identification of the Two Missing Romanov Children Using DNA Analysis. PLoS ONE , e4838. doi:10.1371/journal.pone.0004838.

Gill, P., Kimpton, C., Aliston-Greiner, R., Sullivan, K., Stoneking, M., Melton, T., y otros. (1994). Establishing the identity of Anna Anderson Manahan. Nature Genetics , 9: 9-10.

González-Martín, A. (2003). Del origen del hombre a la familia Romanov. Archivos, huesos y genes para reconstruir nuestra historia. Consejo Superior de Investigaciones Científicas, México. Nuevo México.

Hummel, S. (2003). Ancient DNA typing: methods, strategies and applications. Springer.

Ivanov, P. L., Wadhams, M. J., Roby, R., Holland, M., Weedn, V., & PArsons, T. (1996). Mitochondrial DNA sequence heteroplasmy in the Grand Duke of Russia Georgij Romanov establishes the authenticity of the remains of Tsar Nicholas II. Nature Reviews Genetics , 12 (4):417-420.

Parsons, T. J., & Coble, M. D. (2001). Increasing the forensic discrimination of mitochondrial DNA testing through analysis of the entire mitochondrial DNA genome. Forensic Sciences , 42 (3): 3004-309.

ADN mitocondrial e identificación de individuos

Análisis de DNA mitocotondrial en la ciencia forense:

                El DNA mitocotondrial (mtDNA) es una molécula circular de DNA extracromosómico de transmisión no mendeliana, ya que sólo el gamento femenino aporta una copia a la formación del cigoto. A muy grandes rasgos ha de decirse que contiene genes codificantes para elementos proteicos clave en el metabolismo energético mitocotondrial, así como regiones de control. Las secuencias codificantes carecen de intrones, al igual que el cromosoma procariota. La región de control contiene los promotores mayores de transcripción, así como el origen de replicación de la hebra pesada. Además, se incluyen dentro de la misma dos regiones hipervariables I e II (HV-I e HV-II, respectivamente) polimórficas. La HV-I se ubica entre la posición 16.024 hasta la 16.365 y la HV-II abarca desde la posición 73 a la 340. Ambas regiones representan puntos calientes con una elevada tasa de mutación, mostrando  un considerable número de SNPs. En base a la variabilidad en tales regiones se han establecido múltiples tipos de DNAmt, que se conocen como haplotipos o miotipos.

El DNA mitocotondrial está sometido a una tasa de mutación muy baja ya que al tratarse de una molécula haploide no existe posibilidad de recombinación, por lo que las réplicas del mtDNA se suelen mantener constantes de generación en generación. En otras palabras, el mtDNA es haploide y su secuencia se puede considerar como un locus único (haplotipo), refiriéndonos a sus variantes como alelos. Además ha de indicarse que la herencia es estrictamente materna, por lo que su estudio permite establecer conclusiones acerca de la filogenia materna. Por lo general, cada individuo presenta un único haplotipo, situación conocida como homoplasmia. No obstante, si se incorpora una mutación en el DNAmt de una mujer, todo el linaje posterior presentará dos poblaciones de mitocondrias diferenciadas en tal posición, hablando pues de un individuo heteroplásmico. Es condición indispensable que para ello dicha mutación se incluya en la línea germinal para que se produzca su herencia. Por lo general, la situación de heteroplasmia se pierde a las pocas generaciones debido al azar (deriva génica) o a que dicha nueva variante no se incluya en la línea germinal.

Su análisis en el ámbito forense y de identificación está restringido a circunstancias muy concretas en las que no es posible emplear los métodos habituales de DNA nuclear, como puede ser a partir de huesos, de restos de uñas o de pelo telógeno. En la práctica el análisis de DNA mitocotondrial se emplea de forma rutinaria en las ciencias antropológicas para la identificación y establecimiento de linaje de restos óseos, como por ejemplo fósiles.

El análisis implica por lo general la secuenciación completa de las regiones hipervariables. La coincidencia aleatoria de miotipos no emparentados es de aproximadamente un 0.5-1%. De todos modos, esta aproximación es un valor medio para todos los alelos existentes y, para un mtDNA en concreto la posibilidad de coincidencia dependerá de la rareza de tal variante alélica. De hecho, en las poblaciones estudiadas hasta la fecha se ha encontrado un importante porcentaje de alelos raros a baja o muy baja frecuencia. Por ejemplo, de los 1175 alelos diferentes determinados en las poblaciones caucásicas norteamericanas, 982 son únicos (esto es, hallados en un único individuo en una población concreta), dentro de las bases de datos disponibles. (Parsons & Coble, 2001). Lejos de considerar este hecho como la posibilidad de encontrarnos ante un posible marcador específico de individuo cuya coincidencia pueda permitir la identificación definitiva, ha de tenerse en cuenta que la información disponible en las bases de datos hasta la fecha es relativamente limitada, por lo que se requieren estudios poblacionales más exhaustivos. En la misma población, la frecuencia del alelo más común (263G, 315.1C) es del 7%, en tanto que  aparecen hasta 13 tipos de mtDNA con frecuencias próximas o superiores al 0,5%. Debido a ello se opta por analizar la secuencia completa del DNAmt, mucho más informativa.

Parsons, T. J., & Coble, M. D. (2001). Increasing the forensic discrimination of mitochondrial DNA testing through analysis of the entire mitochondrial DNA genome. Forensic Sciences , 42 (3): 3004-309.